Hydrobiologické vyšetřování vod

Při biologické analýze je potřeba zvolit vhodné metody odběru vzorků, metody úpravy vzorků a vhodný způsob vyjádření výsledku a vše uzpůsobit účelu, ke kterému mají výsledky sloužit. Biologické vyšetřování vod je založeno zjm. na mikroskopickém rozboru a stanovení mikroskopického obrazu, kdy se zjišťuje přítomnost a počet mikroorganismů v 1 ml vody. Biologický rozbor vod se řídí zásadami uvedenými v normě ČSN 75 7712 pro stanovení biosestonu (viz kvalitativní a kvantitativní stanovení biosestonu) a normou ČSN 75 7713 pro stanovení abiosestonu (viz stanovení abiosestonu). Stanovení mikroskopického obrazu, dle ČSN 75 7712, je založeno na centrifugaci standardního objemu vzorku vody a kvantifikaci mikroorganismů v počítací komůrce. Pro biologický rozbor je potřeba mít k dispozici v laboratoři toto vybavení (viz obr. 1): centrifugu s výkyvným nebrzděným rotorem (standardizace), kalibrované centrifugační zkumavky s kónickým hrotem, mikropipetky, počítací komůrky typu Cyrus a světelný mikroskop vybavený fluorescencí (viz obr. 2). Do centrifugační zkumavky s kónicky zúženým hrotem, kalibrované na 10 ml (na stěně zkumavky jsou navíc rýžky udávající objem od hrotu zkumavky, a to na 0,1 ml, 0,2 ml, 0,5 ml a 1 ml) se nalije 10 ml promíchaného vzorku vody. Vzorek se přenese do centrifugy (výběr centrifugy je standardizován, pro biologický rozbor je jako jediná vhodná centrifuga s výkyvným nebrzděným rotorem) a odstřeďuje se. (Doporučená doba odstřeďování je 5 minut, rychlost otáček 2 000 za minutu.) Po odstředění se supernatant odlije (viz obr. 3) rychlým překlopením zkumavky do vodorovné polohy hrdlem dolů, kapky ulpělé na hrdle se odsají mikropipetkou. Obrácením zkumavky hrotem dolů se zahuštěný objem v hrotu zkumavky ustálí na 0,2 ml (druhá rýha od spodu hrotu). Není-li dodržen objem 0,2 ml je nutné ho upravit, mikropipetkou podíl ve zkumavce promíchat a centrifugovat po dobu 1 minuty při stejných otáčkách. Kapka takto upraveného vzorku se z hrotu zkumavky přenese na mřížku počítací komůrky Cyrus I., ve které se zjišťuje nejen druhové ale i početní zastoupení taxonů (viz obr. 4) v 1 ml tohoto vzorku. Součástí mikroskopického rozboru je rozlišení živých a mrtvých buněk sinic a řas na základě autofluorescence asimilačních pigmentů. Živé buňky (viz obr. 5) mají aktivní asimilační pigmenty zářící při dopadu excitačního záření (UV, fialová, modrá či zelená část spektra) cihlově až karmínově červeně. Intenzita fluorescence závisí na stáří buněk, kdy starší buňky září pod fluorescencí intenzivněji než buňky mladší. Mrtvé buňky (viz obr. 6) jsou zelenomodré.

(Poznámka: Komplexní biologický rozbor představuje hydrobiologický rozbor se zaměřením na mikroskopickou analýzu se stanovením biosestonu a abiosestonu a v neposlední řadě i mikrobiologický rozbor se zaměřením na kultivaci bakterií a popř. i mikromycet.)

Obr. 1: Pomůcky používané při mikroskopickém rozboru vzorků, centrifugační zkumavky, mikropipetky, podložní a krycí skla.

Obr. 2: Binokulární světelný mikroskop vybavený fluorescenčním nástavcem a lampou.

Obr. 3: Centrifugační zkumavka po centrifugaci a po slití supernatantu, zahuštěný podíl ve hrotu zkumavky se převádí mikropipetkou na podložní sklo či na rastr počítací komůrky.

Obr. 4: Mikroskopický pohled na rastr počítací komůrky Cyrus I. se zachycenými organismy, které se prohlížejí a následně počítají v jednotlivých polích.

Obr. 5: Živá buňka rozsivky Nitzschia acicularis pod světelným mikroskopem za běžného osvětlení a při použití fluorescence.

Obr. 6: Mrtvá buňka rozsivky Nitzschia acicularis pod světelným mikroskopem za běžného osvětlení a při použití fluorescence.