angl. mechanism of enzyme action. Katalytický cyklus enzymu můžeme rozdělit na tři fáze: vazbu
substrátu do aktivního centra enzymu, jeho přeměnu na produkt a desorpci produktu.
Pro objasnění mechanismu vazby substrátu (zejména pro vysvětlení substrátové specifity enzymu) byl již před více než 100 lety navržen model zámku a klíče (enzym představuje zámek a substrát klíč, který komplementárně vyplní zámek). Později byl tento statický model doplněn o představu, že substrát a enzym se při interakci ovlivňují a vyvolávají jeden u druhého změny prostorového uspořádání na úrovni konformace (model indukovaného přizpůsobení). Zajímavé je zejména přizpůsobení enzymové makromolekuly obvykle mnohem menšímu substrátu (viz konformační dynamika). Naopak vazbou substrátu do vazebného místa se, zejména u konformačně nestabilních substrátů, stabilizuje jedna z jeho možných konformací. Vazbu substrátu na enzym charakterizuje substrátová konstanta, tj. disociační konstanta komplexu enzym–substrát.
Vlastní katalytickou přeměnu zajišťuje několik málo katalytických skupin, které jsou součástí aktivního místa a jsou v přímém, stereochemicky přesně určeném kontaktu s navázaným substrátem; u složených enzymů zajišťují tuto funkci především prostetické skupiny nebo ionty kovů.
Desorpce produktu (produktů) je jistou analogií vazby substrátu (substrátů); u některých enzymových reakcí je tento krok v celé sekvenci událostí tím nejpomalejším.