angl. substrate-level phosphorylation, vedle membránové fosforylace jediný způsob syntézy nukleosidtrifosfátů, zejména ATP. Jedná se buď o přenos fosfátového zbytku z makroergického substrátu (fosfoenolpyruvátu, 1,3-bisfosfoglycerátu, kreatinfosfátu) na ADP pomocí enzymů z třídy transferas, nebo o obrácenou reakci katalyzovanou ligasou (např. sukcinyl-CoA + GDP + P_i→ sukcinát + CoA + GTP, sukcinyl-CoA-ligasa, EC 6.2.1.4, reakce citrátového cyklu).