Test toxicity na řasách
|
|
Toxicity tests on algae
|
Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus quadricauda,
S. subspitatus, Selenastrum capricornutum je standardizována
metodikou ČSN EN ISO 28692. Princip testu spočívá ve stanovení
toxického účinku vodou vyluhovatelné látky na inhibici růstu a
rozmnožování chlorokokální řasy v jednotlivých koncentracích
sledované látky ve srovnání s kontrolami v čistém živném roztoku (viz obr. 1).
Při testu je vhodné zaznamenávat i odchylky od normálního tvaru buněk (viz obr. 2a–f).
Pro testovaní lze použít kulturu chlorokokální řasy Scenedesmus quadricauda kmen Greifswald 15 (viz obr. 3). Kmenová kultura se udržuje na šikmém
1,5 % agaru ve standardním živném médiu (KNOPŮV roztok či roztok
dle ISO) v zazátkovaných zkumavkách sterilně uložených v termoluminostatu
s osvětlením minimálně 6 000 luxů. V případě potřeby se kultura
přeočkovává do živného média o objemu cca 100 ml do 250 ml Erlenmayerových
baněk, čímž se připraví zásobní inokulační kultura řas, udržovaná za
stejných podmínek jako kmenová kultura. Řasové inokulum pro test se
odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury. Nejprve se zjistí
hustota inokulační kultury v počítací komůrce Cyrus I. (viz obr. 4) Po přípravě ředící
řady testované látky se ke každé koncentraci i ke kontrole přidá stejný
objem řasové suspenze, jejíž množství se zjistí výpočtem. Počáteční hustota
řasové suspenze po naočkování by měla odpovídat počtu 20 000 cenobií
v 1 ml (viz cenobium).
Kultivační baňky se vzorky o objemu 50 ml s inokulem uzavřou
buničitými zátkami a umístní se do termoluminostatu (viz obr. 5) s osvětlením
6 000 až 10 000 luxů a teplotou 27 °C ± 2 °C. Test probíhá po
dobu minimálně 72 hodin, během této doby se vzorek alespoň
třikrát denně promíchává. Od počátku až po konec testu se hodnotí
růst řasových buněk v nasazených koncentracích s četností
jednou denně. Při zvolené delší době expozice se hodnocení
provádí řádově v dvou až čtyřdenních intervalech. Hustota
buněk se zjišťuje pomocí počítací komůrky Cyrus I.
Na konci testu se z naměřených hodnot zjišťuje růstová
rychlost µ a integrál biomasy A, nebo-li plochy pod růstovými
křivkami, v jednotlivých vzorcích a z těchto hodnot se v
porovnání s kontrolní koncentrací stanoví inhibice Iµ
a IA.
Z obou hodnot inhibic lze stanovit inhibiční koncentraci IC50,
u které lze rozlišit způsob výpočtu koeficienty. V případě
použití hodnoty Iµ se používá označení IrC50 (index r značí
použití hodnoty růstové rychlosti), obdobně při použití
hodnoty IA se používá označení
IrC50 (index b značí použití
hodnoty velikosti vytvořené biomasy). Koncentrace 72hIC50
se stanovuje stejným způsobem, jako v případě předchozích
testů, tzn. probitovou regresní analýzou.
V případě, kdy je Iµ menší než 0,
jedná se o stimulaci růstu.
V případě, kdy je IA
menší než 0, jedná se o stimulaci růstu.
Zjištěné inhibice jsou převedeny na probity a vyneseny do grafu na
ose y proti logaritmům koncentrací na ose x, lineární regresí je
vypočítána hodnota IC50.
|
Obr. 1: Jednotlivé testované koncentrace zkoušené látky v Erlenmayerových baňkách s chlorokokální řasou Scenedesmus quadricauda. Kultura řasy v zásobní baňce.
|
|
Obr. 2a: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 2b: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 2c: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 2d: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 2e: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 2f: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
Obr. 3: Chlorokokální řasa Scenedesmus quadricauda kmen Greifswald 15 (čtyřbuněčné cenobium) na rastru počítací komůrky.
|
|
Obr. 4: Pomůcky pro test toxicity na řasách, zásobní kultura s řasou, počítací komůrka, Erlenmayerovy baňky, mikropipetky.
|
|
Obr. 5: Umístění Erlenmayerových baněk se zkoušenými látkami do termoluminostatu.
|
Grafy souvislostí do úrovně:
I
II
III