Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus quadricauda, S. subspitatus, Selenastrum capricornutum je standardizována metodikou ČSN EN ISO 28692. Princip testu spočívá ve stanovení toxického účinku vodou vyluhovatelné látky na inhibici růstu a rozmnožování chlorokokální řasy v jednotlivých koncentracích sledované látky ve srovnání s kontrolami v čistém živném roztoku (viz obr. 1). Při testu je vhodné zaznamenávat i odchylky od normálního tvaru buněk (viz obr. 2a–f). Pro testovaní lze použít kulturu chlorokokální řasy Scenedesmus quadricauda kmen Greifswald 15 (viz obr. 3). Kmenová kultura se udržuje na šikmém 1,5 % agaru ve standardním živném médiu (KNOPŮV roztok či roztok dle ISO) v zazátkovaných zkumavkách sterilně uložených v termoluminostatu s osvětlením minimálně 6 000 luxů. V případě potřeby se kultura přeočkovává do živného média o objemu cca 100 ml do 250 ml Erlenmayerových baněk, čímž se připraví zásobní inokulační kultura řas, udržovaná za stejných podmínek jako kmenová kultura. Řasové inokulum pro test se odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury. Nejprve se zjistí hustota inokulační kultury v počítací komůrce Cyrus I. (viz obr. 4) Po přípravě ředící řady testované látky se ke každé koncentraci i ke kontrole přidá stejný objem řasové suspenze, jejíž množství se zjistí výpočtem. Počáteční hustota řasové suspenze po naočkování by měla odpovídat počtu 20 000 cenobií v 1 ml (viz cenobium).

Kultivační baňky se vzorky o objemu 50 ml s inokulem uzavřou buničitými zátkami a umístní se do termoluminostatu (viz obr. 5) s osvětlením 6 000 až 10 000 luxů a teplotou 27 °C ± 2 °C. Test probíhá po dobu minimálně 72 hodin, během této doby se vzorek alespoň třikrát denně promíchává. Od počátku až po konec testu se hodnotí růst řasových buněk v nasazených koncentracích s četností jednou denně. Při zvolené delší době expozice se hodnocení provádí řádově v dvou až čtyřdenních intervalech. Hustota buněk se zjišťuje pomocí počítací komůrky Cyrus I.

Na konci testu se z naměřených hodnot zjišťuje růstová rychlost µ a integrál biomasy A, nebo-li plochy pod růstovými křivkami, v jednotlivých vzorcích a z těchto hodnot se v porovnání s kontrolní koncentrací stanoví inhibice I_µ a I_A. Z obou hodnot inhibic lze stanovit inhibiční koncentraci IC₅₀, u které lze rozlišit způsob výpočtu koeficienty. V případě použití hodnoty I_µ se používá označení I_rC₅₀ (index r značí použití hodnoty růstové rychlosti), obdobně při použití hodnoty I_A se používá označení I_rC₅₀ (index b značí použití hodnoty velikosti vytvořené biomasy). Koncentrace _72hIC₅₀ se stanovuje stejným způsobem, jako v případě předchozích testů, tzn. probitovou regresní analýzou.

V případě, kdy je I_µ menší než 0, jedná se o stimulaci růstu.

V případě, kdy je I_A menší než 0, jedná se o stimulaci růstu.

Zjištěné inhibice jsou převedeny na probity a vyneseny do grafu na ose y proti logaritmům koncentrací na ose x, lineární regresí je vypočítána hodnota IC₅₀.

 

---

Obr. 1: Jednotlivé testované koncentrace zkoušené látky v Erlenmayerových baňkách s chlorokokální řasou Scenedesmus quadricauda. Kultura řasy v zásobní baňce.

 

---

	Obr. 2a: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
	Obr. 2b: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
	Obr. 2c: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
	Obr. 2d: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
	Obr. 2e: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.
	Obr. 2f: Odchylky od normálního tvaru buněk cenobií řasy Scenedesmus quadricauda.

 

---

Obr. 3: Chlorokokální řasa Scenedesmus quadricauda kmen Greifswald 15 (čtyřbuněčné cenobium) na rastru počítací komůrky.

 

---

Obr. 4: Pomůcky pro test toxicity na řasách, zásobní kultura s řasou, počítací komůrka, Erlenmayerovy baňky, mikropipetky.

 

---

Obr. 5: Umístění Erlenmayerových baněk se zkoušenými látkami do termoluminostatu.

  Grafy souvislostí do úrovně:      I       II       III